大家好，本期百代大课堂主要讲解miRNA茎环逆转录与荧光定量的相关知识点。如需了解miRNA加尾法可查阅上期视频内容。本次视频分为以下四个内容。
·第一部分：miRNA茎环法逆转录原理。该原理是利用一种稳定的双链结构，茎环(stem-loop)结构作为逆转录引物，与miRNA中目标序列互补结合，形成DNA/RNA复合体。随后利用逆转录酶将RNA序列逆转录为cDNA，从而实现miRNA表达的测量和分析等功能。下图所示即是miRNA茎环法原理及过程。
·第二部分：miRNA茎环逆转录实验步骤。
→第一步：rt反应液配置。取RNase-free离心管，注意：
→1.Specific Primer指miRNA的上游特异性引物，该引物一般由研究者自行设计合成，百代生物也可免费提供设计。
→2.Tag Primer一般指miRNA的反向引物。
·第二步：设置反应条件，进行荧光定量PCR反应。注意仪器类型不同，熔解曲线采集程序不同，使用仪器默认熔解曲线采集程序即可。
·第四部分：一起来看一下miRNA茎环法常见问题。
→1、如何提高miRNA检测的精确度？研究者对实验结果的精确度有高要求时，建议选择miRNA茎环法逆转录和荧光定量。茎环法最大的特点就是其逆转录和qPCR都是序列特异性的，对于每一个待检测的miRNA都需要设计独特的逆转录引物以及qPCR引物。
建议找设计经验丰富的生物公司进行设计，如百代生物等，搭配其BIOG miRNA茎环法逆转录试剂盒，与荧光定量试剂盒一起使用，可确保实验结果的特异性和灵敏度。尤其是其中针对性设计的茎环逆转录引物，一方面能够有效延长miRNA长度，另一方面又可利用自身的互补构象防止与其他序列结合，从而减少了非特异结合，提高实验结果的精确度。
并且百代生物还可免费提供miRNA上下游引物的设计合成服务。
→2、miRNA加尾法和茎环法的区别？miRNA加尾法和茎环法的目的都是为了延长miRNA长度，其区别是：
→1.延长方式不同。加尾法是对所有miRNA无差别化，加上polyA尾巴来延长CDNA长度。而茎环法是通过设计带有茎环结构的引物，与目的miRNA特异性结合来进行延长。
·2.适用的实验需求不同。加尾法属于高通量逆转录，适用于大量miRNA的筛选检测。而茎环法属于特异性逆转录，适用于少量目标miRNA的精确定量检测。另外，miRNA茎环法的检测灵敏度、特异性、精确度都要优于加尾法，研究者需要根据具体实验需求选择最合适的方法。
·3、miRNA采用茎环法进行逆转录时，可以在一管中同时添加多个逆转录引物吗？不建议！如若研究多个目的miRNA，则每个miRNA都需要分开进行逆转录，否则在一管中同时投入多个茎环引物进行多个miRNA逆转时，不同特异性茎环引物的茎环结构之间会产生相互干扰和影响。
但BIOG miRNA茎环法逆转录试剂盒有一些特别的设计，可在同一个逆转录体系中同时添加U6(内参)逆转录引物和茎环逆转录引物，两者可同时进行逆转录，而不会出现相互干扰和影响的问题。
这期内容就分享到这，感谢您的观看！