前面介绍了体外展示技术mRNA展示，与之类似的是核糖体展示，关键点都是基因型和表型一一对应，前者利用嘌呤霉素将蛋白肽与编码mRNA联系起来，而后者则是通过产生非共价三元复合物(多肽-核糖体- mRNA)来实现。mRNA上的翻译终止密码子的消除确保了新合成的肽及其编码mRNA不能从核糖体中释放出来。正常情况下，多肽和mRNA的释放分别通过释放因子(RFs)和核糖体再循环因子(RRFs)来实现。
- mRNA展示 (i)双链DNA生成含有3 '嘌呤霉素的mRNA模板用于翻译; (ii) mRNA-嘌呤霉素偶联物在体外翻译以产生mRNA-蛋白融合; (iii) cDNA合成后，使用固定化靶标筛选mRNA融合蛋白; (iv) PCR获得功能序列富集的双链DNA。
- 核糖体展示 (i)双链DNA用于生成mRNA翻译模板；(ii)短暂孵育后，通过添加Mg2+和低温孵育或添加翻译抑制剂来停止翻译，然后使用固定化靶标筛选核糖体复合物；(iii)使用mRNA(纯化或直接)构建cDNA；(iv)PCR生成双链DNA。A代表核糖体的氨基酰基tRNA结合位点；P代表肽基tRNA结合位点。
核糖体展示DNA盒包含六个片段, 以目标肽基因为核心，其5 '上游是T7启动子、茎环和翻译起始序列(原核Shine-Dalgarno或真核Kozak序列)，其3’下游是间隔序列和3 '位点的茎环。间隔序列可以是丝状噬菌体M13的基因III、Igκ链的恒定区和人类IgM的CH3结构域，间隔序列长度会影响显示效率。
核糖体展示大致流程
1）PCR产物形式的DNA文库可以连接到核糖体展示载体pRDV中，将蛋白肽编码基因与tolA间隔序列融合，并在5 '端提供启动子和翻译起始区；2）最终的核糖体展示结构是通过PCR扩增两侧区域和连接载体上的文库插入得到的；3）该PCR产物的体外转录产生用于体外翻译的mRNA。核糖体停留在mRNA的末端，由于缺少停止密码子，核糖体不能释放编码和正确折叠的蛋白质；4）mRNA -核糖体-蛋白三元复合物用于对固定靶标的亲和力选择；5）结合复合物的mRNA经过洗涤、逆转录和PCR扩增后恢复；6）富集的PCR产物可直接用于下一轮核糖体展示或克隆到表达载体进行单克隆分析。
mRNA recovery方法
1）原核核糖体解离，利用特定浓度的EDTA解离三元复合物。释放的mRNA必须经过纯化，以便进行后续的RT-PCR扩增。2）真核核糖体原位RT-PCR，直接从选定的核糖体复合物中回收DNA，无需复合物解离和mRNA纯化。这种方法简化了程序，并极大地减少了由于降解而导致的mRNA丢失，它还可以加速核糖体展示的自动化。但是，当选择轮次在固定的抗原或细胞单层上进行时则无法使用原位RT-PCR。实验表明，原核核糖体解离条件对于从真核核糖体结合的mRNA中恢复DNA的效率不及原位RT-PCR。
参考来源
- Li, Ruowei; Kang, Guangbo; Hu, Min; Huang, He (2018). Ribosome Display: A Potent Display Technology used for Selecting and Evolving Specific Binders with Desired Properties. Molecular Biotechnology, (), –. doi:10.1007/s12033-018-0133-0
- Kunamneni, Adinarayana; Ogaugwu, Christian; Bradfute, Steven; Durvasula, Ravi (2020). Ribosome Display Technology: Applications in Disease Diagnosis and Control. Antibodies, 9(3), 28–. doi:10.3390/antib9030028
- Zahnd, Christian; Amstutz, Patrick; Plückthun, Andreas (2007). Ribosome display: selecting and evolving proteins in vitro that specifically bind to a target. , 4(3), 269–279. doi:10.1038/nmeth1003
- Gold, L. (2001). mRNA display: Diversity matters during in vitro selection. Proceedings of the National Academy of Sciences, 98(9), 4825–4826. doi:10.1073/pnas.091101698
- Richard W Roberts (1999). Totally in vitro protein selection using mRNA-protein fusions and ribosome display. , 3(3), 268–273. doi:10.1016/s1367-5931(99)80042-8
- Mattheakis, L. C.; Bhatt, R. R.; Dower, W. J. (1994). An in vitro polysome display system for identifying ligands from very large peptide libraries.. Proceedings of the National Academy of Sciences, 91(19), 9022–9026. doi:10.1073/pnas.91.19.9022
- Hanes, J.; Pluckthun, A. (1997). In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. Proceedings of the National Academy of Sciences, 94(10), 4937–4942. doi:10.1073/pnas.94.10.4937
- Glen Cho; Anthony D Keefe; Rihe Liu; David S Wilson; Jack W Szostak (2000). Constructing high complexity synthetic libraries of long ORFs using In Vitro selection. , 297(2), 0–319. doi:10.1006/jmbi.2000.3571